🚀David Baker Preprint von @UWproteindesign 👇👇 Was macht das Schneiden von Proteinbindungen so herausfordernd, dass die Natur spezialisierte Enzyme mit Metallcofaktoren entwickelt hat, um dies zu erreichen?@biorxivpreprint @ETH_en "Computational design of cysteine proteases" • Amidbindungen in Proteinen haben Halbwertszeiten von Hunderten von Jahren unter physiologischen Bedingungen, was sie viel stabiler macht als Esterbindungen (mit Aminabgangsgruppen, die pKa >35 gegenüber <8 für aktivierte Ester haben), und das bisherige computergestützte Enzymdesign war nur mit aktivierten kleinen Molekülester-Substraten erfolgreich, anstatt mit dem energetisch anspruchsvollen Peptidbindungsschnitt, der für Proteasen erforderlich ist. • Die Forscher verwendeten RoseTTAFold Diffusion 2 für Molekulare Schnittstellen (RFD2-MI), um Zinkproteasen aus minimalen katalytischen Motiven zu entwerfen, indem sie eine ideale aktive Stelle mit fünf funktionellen Gruppen (drei zinkbindende Reste H1, H2, E1, eine katalytische Base E2 und eine oxyanion-stabilisierende Tyrosin Y) basierend auf den Strukturen von Aminopeptidase N und Astacin konstruierten und ein zweiseitiges Design sowohl der Protease- als auch der Substratsequenzen durchführten, um die präzise Positionierung der Zielamidbindung sicherzustellen. • Von 135 Designs, die in einer einzigen Entwurfsrunde getestet wurden, zeigten 36% Aktivität (14,7% für Zn-only Modelle und 87,5% für Zn-Wasser-Modelle), wobei alle aktiven Designs genau an den beabsichtigten Stellen schnitten, was durch Massenspektrometrie bestätigt wurde; das aktivste Design (Zn45 schneidet ZnO36 Substrat) erreichte kcat von 0,025 ± 0,002 s⁻¹, KM von 26 ± 5 μM und kcat/KM von 900 ± 200 M⁻¹s⁻¹, was eine >10⁸-fache Beschleunigung der Rate gegenüber der unkatalysierten Hydrolyse darstellt; die Designs zeigten Zinkbindung mit Kd zwischen 10⁻¹⁰ und 10⁻⁸ M, zeigten Substratspezifität in 4 von 5 Gerüsten und konnten umprogrammiert werden, um das krankheitsrelevante menschliche TDP-43-Protein mit 4 Varianten zu schneiden, die ≥80% Schnitt bei 5 Stunden erreichten. Autoren: Hojae Choi et. al Donald Hilvert, Samuel J. Pellock, David Baker Link: