🚀大卫·贝克来自@UWproteindesign的预印本 👇👇 是什么让切割蛋白质键如此具有挑战性，以至于自然进化出具有金属辅因子的专门酶来完成这一任务？@biorxivpreprint @ETH_en "半胱氨酸蛋白酶的计算设计" • 在生理条件下，蛋白质中的酰胺键的半衰期长达数百年，使其比酯键更稳定（氨基离去基团的pKa >35，而活化酯的pKa <8），而之前的计算酶设计仅在活化的小分子酯底物上取得成功，而不是需要能量密集的肽键断裂，这对于蛋白酶来说是必需的。 • 研究人员使用RoseTTAFold Diffusion 2 for Molecular Interfaces (RFD2-MI)从最小催化基元设计锌蛋白酶，构建了一个理想的活性位点，包含五个功能基团（三个锌结合残基H1、H2、E1，一个催化碱E2和一个稳定负离子的酪氨酸Y），基于氨肽酶N和阿斯塔辛的结构，进行双面设计以确保目标酰胺键的精确定位。 • 在135个设计中，36%显示出活性（仅锌模型为14.7%，锌-水模型为87.5%），所有活性设计在质谱确认的预定位点精确切割；最活跃的设计（Zn45切割ZnO36底物）达到了0.025 ± 0.002 s⁻¹的kcat，26 ± 5 μM的KM，以及900 ± 200 M⁻¹s⁻¹的kcat/KM，代表着比未催化水解快超过10⁸倍；设计表现出锌结合，Kd在10⁻¹⁰到10⁻⁸ M之间，在5个支架中的4个显示底物特异性，并且可以重新编程以切割与疾病相关的人类TDP-43蛋白，4个变体在5小时内实现≥80%的切割。 作者：Hojae Choi等，Donald Hilvert，Samuel J. Pellock，大卫·贝克 链接：