🚀David Baker 來自 @UWproteindesign 的預印本 👇👇 為什麼切割蛋白質鍵如此具有挑戰性，以至於自然進化出專門的酶與金屬輔因子來完成這一任務？@biorxivpreprint @ETH_en "半胱氨酸蛋白酶的計算設計" • 蛋白質中的酰胺鍵在生理條件下的半衰期長達數百年，使其比酯鍵穩定得多（胺離子基團的 pKa >35，而活化酯的 pKa <8），而之前的計算酶設計僅在活化的小分子酯底物上取得成功，而無法實現蛋白酶所需的能量要求高的肽鍵切割。 • 研究人員使用 RoseTTAFold Diffusion 2 for Molecular Interfaces (RFD2-MI) 從最小催化基元設計鋅蛋白酶，構建了一個理想的活性位點，包含五個功能基團（三個鋅結合殘基 H1、H2、E1，一個催化基 E2 和一個穩定負氧離子的酪氨酸 Y），基於氨肽酶 N 和 astacin 結構，進行了蛋白酶和底物序列的雙面設計，以確保目標酰胺鍵的精確定位。 • 在單次設計回合中測試的 135 個設計中，36% 顯示出活性（鋅單一模型為 14.7%，鋅-水模型為 87.5%），所有活性設計在質譜確認的預定位置精確切割；最活躍的設計（Zn45 切割 ZnO36 底物）達到 kcat 為 0.025 ± 0.002 s⁻¹，KM 為 26 ± 5 μM，kcat/KM 為 900 ± 200 M⁻¹s⁻¹，代表著比未催化水解快超過 10⁸ 倍的速率加速；設計顯示鋅結合的 Kd 在 10⁻¹⁰ 到 10⁻⁸ M 之間，在 5 個支架中有 4 個顯示底物特異性，並且可以重新編程以切割與疾病相關的人類 TDP-43 蛋白，4 個變體在 5 小時內達到 ≥80% 的切割。 作者：Hojae Choi 等，Donald Hilvert，Samuel J. Pellock，David Baker 鏈接：