🚀David Baker preprint fra @UWproteindesign 👇👇 Hva gjør det så utfordrende å kutte proteinbindinger at naturen har utviklet spesialiserte enzymer med metallkofaktorer for å oppnå det?@biorxivpreprint @ETH_en "Beregningsdesign av cysteinproteaser" • Amidbindinger i proteiner har halveringstider på hundrevis av år under fysiologiske forhold, noe som gjør dem langt mer stabile enn esterbindinger (med aminforlatende grupper som har pKa >35 mot <8 for aktiverte estere), og tidligere beregningsenzymdesign har kun lykkes med aktiverte småmolekylestersubstrater i stedet for den energikrevende peptidbindingsspaltingen som kreves for proteaser. • Forskerne brukte RoseTTAFold Diffusion 2 for Molecular Interfaces (RFD2-MI) for å designe sinkproteaser fra minimale katalytiske motiver, og konstruerte et ideelt aktivt sted med fem funksjonelle grupper (tre sinkbindende rester H1, H2, E1, én katalytisk base E2 og én oksyanionstabiliserende tyrosin Y) basert på aminopeptidase N- og astacinstrukturer, og utførte tosidig design av både protease- og substratsekvenser for å sikre presis plassering av målamidbindingen. • Av 135 design testet i en enkelt designrunde, viste 36 % aktivitet (14,7 % for kun Zn-modeller og 87,5 % for Zn-vann-modeller), med alle aktive design som kuttet nøyaktig på tiltenkte steder bekreftet av massespektrometri; det mest aktive designet (Zn45-kløvende ZnO36-substrat) oppnådde kcat på 0,025 ± 0,002 s⁻¹, KM på 26 ± 5 μM, og kcat/KM på 900 ± 200 M⁻¹s⁻¹, som representerer >10⁸-dobbel akselerasjon over ukatalysert hydrolyse; design viste sinkbinding med Kd mellom 10⁻¹⁰ og 10⁻⁸ M, viste substratspesifisitet i 4 av 5 stillas, og kunne omprogrammeres til å kløve sykdomsrelevant humant TDP-43-protein med 4 varianter som oppnådde ≥80 % kløvning etter 5 timer. Forfattere: Hojae Choi m.fl. al Donald Hilvert, Samuel J. Pellock, David Baker Lenke: