🚀Preprint de David Baker de @UWproteindesign 👇👇 ¿Qué hace que cortar enlaces proteicos sea tan complicado como para que la naturaleza haya desarrollado enzimas especializadas con cofactores metálicos para lograrlo@biorxivpreprint @ETH_en? "Diseño computacional de proteasas de cisteína" • Los enlaces amida en proteínas tienen vidas medias de cientos de años bajo condiciones fisiológicas, lo que los hace mucho más estables que los enlaces éster (con grupos salientes aminas teniendo pKa >35 frente a <8 para ésteres activados), y el diseño enzimático computacional previo solo ha tenido éxito con sustratos ésteres de molécula pequeña activados en lugar de la exigente escisión energética de enlaces peptídicos necesaria para las proteasas. • Los investigadores utilizaron RoseTTAFold Diffusion 2 para Interfaces Moleculares (RFD2-MI) para diseñar proteasas de zinc a partir de motivos catalíticos mínimos, construyendo un sitio activo ideal con cinco grupos funcionales (tres residuos de unión al zinc H1, H2, E1, una base catalítica E2 y una tirosina estabilizadora oxianión) basados en estructuras de aminopeptidasa N y astacina, realizando un diseño bilateral tanto de secuencias de proteasas como de sustrato para asegurar una posición precisa del enlace amida objetivo. • De 135 diseños probados en una sola ronda de diseño, el 36% mostró actividad (14,7% para modelos solo con Zn y 87,5% para modelos con Zn-agua), con todos los diseños activos que se cortaron con precisión en los lugares previstos confirmados por espectrometría de masas; el diseño más activo (sustrato de ZnO36 que corta ZnO36) logró kcat de 0,025 ± 0,002 s⁻¹, KM de 26 ± 5 μM y kcat/KM de 900 ± 200 M⁻¹s⁻¹, representando una aceleración de >10⁸ veces mayor que la hidrólisis no catalizada; los diseños mostraron unión de zinc con Kd entre 10⁻¹⁰ y 10⁻⁸ M, mostraron especificidad de sustrato en 4 de 5 andamios y podían reprogramarse para clivar la proteína TDP-43 humana relevante para la enfermedad con 4 variantes, logrando un ≥80% de clivagancia en 5 horas. Autores: Hojae Choi y al Donald Hilvert, Samuel J. Pellock, David Baker Enlace: